Aquisição de imagens com lapso de tempo 3D de esferoides com o microscópio confocal FLUOVIEW FV3000: observação contínua por 48 horas da citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC)

A citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) é um dos mecanismos de ação dos medicamentos de anticorpos. As células efetoras, como os monócitos e as células exterminadoras naturais (NK), reconhecem as células-alvo (como as células cancerígenas) ligadas por um anticorpo. Reconhecendo o anticorpo, as células efetoras destroem as células-alvo, liberando fatores citotóxicos que induzem a lise celular. Nesta aplicação, foi realizado um experimento de cocultura tridimensional usando células do câncer de cólon humano (HT-29) e células NK (KHYG-1) com expressão de um receptor Fc gamma (FCγ) funcional na presença de anticorpos monoclonais terapêuticos do EGFR-alvo humano, as quais foram observadas durante 48 horas, usando o microscópio confocal FLUOVIEW FV3000. A aquisição de imagens tridimensionais (3D) resultante da ADCC permitiu compreender como as células NK atacam as células cancerígenas.

Aquisição de imagens de células vivas esferoides em 3D com fototoxicidade reduzida

É difícil adquirir imagens de massas celulares cultivadas em um sistema de cultura 3D (chamadas esferoides) devido à espessura da massa. Normalmente, é necessária uma intensidade de luz de excitação mais alta para produzir um sinal fluorescente suficientemente forte para detecção. Contudo, uma luz de excitação mais alta também aumenta a fototoxicidade, resultando em danos nas células. Para solucionar essa situação, usamos o microscópio FV3000, que incorpora a tecnologia de detecção TruSpectral da Olympus, para capturar sinais fluorescentes fracos e minimizar a potência do laser necessária para geração de sinal dentro de um esferoide. Além disso, foi usada uma objetiva de imersão em óleo de silicone de 60x (correspondendo aproximadamente ao índice de refração de células vivas) para obter imagens mais claras e com resolução mais alta para observação profunda. Combinando essas duas tecnologias, foram capturadas com êxito imagens com lapso de tempo 3D claras de um esferoide durante 48 horas, à medida que ele colapsava devido à morte de células HT-29 mediada por células NK.

Fig. 1: Filme obtido por meio de aquisição de imagens 3D das células NK atacando células tumorais HT-29 esferoides durante 48 horas

A linha de células NK KHYG-1 (verde), com expressão de receptores Fc gamma (FCγ) funcionais e proteínas fluorescentes ZsGreen, foi cultivada com esferoides de células HT-29 (linhas de células derivadas do câncer colorretal). As superfícies das células HT-29 foram rotuladas com um anticorpo monoclonal anti-EGFR cetuximabe (Alexa Fluor 647, azul). As células HT-29 e as células NK foram cultivadas na presença de iodeto de propídio (IP) e a aquisição de imagens XYZT foi realizada ao longo de 48 horas. Foram usados núcleos rotulados em vermelho (assinalando a absorção celular de IP) como um indicador de morte celular.

Condições de aquisição de imagens
Objetiva: objetiva de imersão em óleo de silicone de 60x (UPLSAPO60XS)
Microscópio: sistema FLUOVIEW FV3000
Lasers: 488 nm (ZsGreen, verde), 561 nm (IP, vermelho), 640 nm (Alexa Fluor 647, azul)

Sistema de compensação do desvio Z para aquisição de imagens com lapso de tempo exato

Para experimentos que avaliam a eficácia de medicamentos de anticorpos, é indispensável a aquisição de imagens de células vivas a longo prazo. Para capturar de forma mais precisa o efeito das células NK nas células cancerígenas esferoidais, é usado um compensador do desvio Z (IX3-ZDC2) para impedir alterações no foco causadas por alterações no ambiente externo, como variação da temperatura. O IX3-ZDC2 permitiu obter uma imagem com lapso de tempo durante um período prolongado sem perda do foco do esferoide. Isso permitiu confirmar que as células NK alteram ativamente a sua forma quando atacam e penetram em uma massa tumoral.

9h

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Fig. 2: Linha de células NK KHYG-1 (verde) alterando sua forma enquanto atacam e destroem células tumorais HT-29 rotuladas com cetuximabe (azul). A absorção de IP (vermelho) indica a morte celular.

Como o microscópio confocal FV3000 facilitou nosso experimento

O sistema totalmente espectral proporciona alta sensibilidade

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A série FV3000 usa a tecnologia de detecção TruSpectral da Olympus que difrata a luz por transmissão, por meio de uma unidade de holograma de fase volumétrica. Essa tecnologia, quando comparada a unidades de detecção espectral convencionais com grades de tipo refletivo, permite um rendimento de luz muito superior e minimiza a potência do laser necessária para a observação de tecidos profundos.

Manutenção do foco com o sistema de compensação do desvio Z (ZDC)

O compensador do desvio Z IX3-ZDC2 usa luz infravermelha com fototoxicidade mínima (laser de classe 1) para identificar a localização do plano da amostra. O modo de foco automático (AF) de um disparo permite a configuração de várias posições de foco para amostras mais profundas, permitindo aquisições eficientes de empilhamento Z em experimentos de multiposição.

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As objetivas de imersão em silicone para aquisição de imagens de células vivas proporcionam uma observação de alta resolução em profundidade

O índice de refração do óleo de silicone (ne≈1,40) é similar ao do tecido vivo (ne≈1,38), permitindo observações profundas de alta resolução dentro do tecido vivo com pouca aberração esférica causada pela disparidade do índice de refração. Além disso, o óleo de silicone não seca nem endurece, por isso não existe a necessidade de reabastecer o óleo, tornando-o ideal para observações com lapso de tempo prolongado.

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Comentário do Dr. Yuji Mishima

Agradecimentos
Esta nota de aplicação foi preparada com a ajuda dos seguintes pesquisadores: 
Centro de Quimioterapia para Câncer de JFCR, Dr. Yuji Mishima